产品介绍：

 相比以前的方法如 MTT 检测，Cell Counting Kit-8（CCK-8）为细胞数测定和细胞增殖/毒性测 定的研究提供了更方便和灵敏的方法。我们使用了一种高水溶性的四唑盐，WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodiu m salt]，它在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性 formazan 形式的染料。我们的产品 CCK-8 已经与电子耦合试剂混合，是即用型。WST-8 可被活细胞中丰富的脱氢酶 还原，转化为 formazan 形式，这是一种可溶于培养基的橙色染料。脱氢酶产生 的 formazan 的量与活细胞的数量呈直接的线性关系。究表明，CCK-8 的检测灵敏度高于其他四唑盐，如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1。由于 WST-8 formazan 是水溶性的，因此不再需要添加 DMSO 等有机溶剂。WST-8 formazan 在 450nm 处 的吸光度与培养基中活细胞的数量呈线性关系，活细胞数可以使用对应的吸光度值和标准曲  线确定。CCK-8 检测也可以代替[3H]-thymidine 掺入检测。 

方法使用：

一．细胞活性检测

1. 将细胞悬液（100 μl /孔）接种在 96 孔板中。在潮湿的培养箱中预培养一定时间（例如， 在 37℃，5％CO2下）。

2. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰 O.D. 值检测。

3. 将培养板放在培养箱中孵育 1-4 小时。

4. 使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

如果不立刻测量吸光度，可在每个孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，盖好并在室温下 避光保存。24 小时内不会观察到吸光度变化。

二,细胞增殖/毒性检测

1. 在 96 孔板中每孔接种 100 μl 细胞悬液（约 5000 个细胞/孔）。将板在潮湿的培养箱中预 培养 24 小时（例如，在 37℃，5％CO2下）。

2. 向孔中加入 10 μl 不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱中孵育适当的时间长度（例如，6, 12, 24 或 48 小时）。

4. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰 O.D. 值检测。

5. 将培养板在培养箱中孵育 1-4 小时。

6. 在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。 如果不立刻测量吸光度，可在每个孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，盖好并在室温下 避光保存。24 小时内不会观察到吸光度变化

数据分析：

  统计分析有几种方法，您可以选择使用 O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。 细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100 抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100 As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8 和待测化合物的孔的吸光度） Ab =空白孔吸光度（含有培养基和 CCK-8 的孔的吸光度） Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和 CCK-8 的孔的吸光度

制作标准曲线：

1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数

2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要 5-7 个浓度梯度，每组几个 复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养 板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）

3. 培养直至细胞贴壁（通常 2-4 小时），然后每 100 μL 培养基加入 10 μL CCK-8。继续孵育 1-4 小时，用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。制作出一条以细胞数为 X 轴坐标，O.D.值为 Y 轴坐标的标准曲线。

可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

注意事项 ：

1. 确保药物和 CCK-8 均匀分布在培养基中。

2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。

3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要 1000 个细胞（100 μl 培养基）。对于白细胞，由于灵敏度 较低，每孔至少需要 2500 个细胞（100 μl 培养基）。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000. 如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整 CCK-8 的体积， 使其为每孔总液体体积的 10％。

4. 因为 CCK-8 测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能 导致实际活细胞数与使用 CCK-8 测定活细胞数之间有差异。

5. WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会 干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

6. 孵育 2 小时后，背景 O.D.值一般为 0.1-0.2 单位。

7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰 O.D.值。

8. 如果您想对 CCK-8 溶液进行灭菌，请使用 0.2 μm 的膜过滤溶液。

9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的 孵育时间（长达 4 小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。

10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在 600nm 或更高波长的 O.D 值。

11. CCK-8 不能用于细胞染色。

12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中 本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

13. CCK-8的毒性非常低，在CCK-8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如 结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）

14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。

15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。

16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发， 可以用PBS，水或培养基填充这些孔。

17. 如果您没有 450 nm 滤光片。您也可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之间的滤光片, 450 nm 滤光片具有最佳灵敏度。

18. 测量 450 nm 处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定 650 nm 处的吸光度。

19. 药物中金属离子的存在可能会影响 CCK-8 的灵敏度。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯 化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100% 抑制。

需要的的设备和材料：

酶标仪 (450 nm 滤光片)

96 孔板

10 μl, 100-200 μl 多通道移液器

细胞 CO2培养箱

货号选择：

存储方法：

4℃保存，有效期一年，长期保存建议-20℃保存，避免反复冻融。